Metody molekulární cytogenetiky a cytogenomiky

Základní metodou molekulární cytogenetiky je hybridizace in situ, která se používá v různých metodických obměnách.

Tato metoda umožňuje zviditelnit sekvence nukleových kyselin přímo na mikroskopických preparátech obsahující morfologicky zachovalé chromozomy či buněčná jádra. Molekulární hybridizace in situ je založena na použití značené jednořetězcové hybridizační sondy, tj. krátkého úseku DNA. Tato sonda se v důsledku komplementarity bází může po denaturaci vázat k cílové sekvenci DNA buněk nacházejících se na mikroskopickém skle. Podle místa, kam DNA sondy hybridizují, je rozdělujeme na cetromerické, celochromozomové a genově specifické.

V současné době se nejčastěji používají sondy přibližně 200-300 kb velké, které jsou konjugovány s některými z fluorochromů (např. SpectrumGreen, SpectrumOrange), a proto se tato technika označuje jako fluorescenční in situ hybridizace (FISH). Místa, kam se sonda navázala, můžeme identifikovat za použití fluorescenčního mikroskopu. Počet a poloha jednotlivých fluorescenčních signálů nás potom informuje o možných početních i strukturních změnách chromozomů. Podle počtu cílových sekvencí, které lze simultánně detekovat na jednom preparátu, rozlišujeme jednobarevnou, dvoubarevnou či vícebarevnou fluorescenční in situ hybridizaci.

Technika MLPA (multiplex ligation-dependent probe amplification) je nová metoda molekulární-cytogenetiky, kterou na OLG FN Brno využíváme od roku 2006. Principem této metody je navázání oligonukleotidových sond na cílovou sekvenci DNA na základě jejich komplementarity. Každá sonda se skládá ze dvou oligonukleotidů. Po hybridizaci na cílové místo jsou oligonukleotidy spojeny ligací. Pouze spojené sondy jsou po denaturaci amplifikovány pomocí klasické PCR reakce za použití jednotného páru primerů. Namnožené sondy jsou rozděleny kapilární elektroforézou na základě jejich různé délky. Nakonec jsou analyzovány pomocí speciálního počítačového programu.

Výhodou této metody je, že lze vyšetřovat až 40 různých úseků DNA najednou pomocí jednoho reakčního kitu MLPA. Je možné testovat velký počet DNA vzorků současně, což je velmi efektivní v rutinní diagnostice. Je to technika vysoce citlivá, dokáže detekovat i sekvence lišící se v jednom nukleotidu. K jedné MLPA reakce je třeba pouze 20ng DNA, která může být různého původu (izolovaná z periferní krve, plodové vody, nádorové tkáně...). Metoda MLPA dokáže detekovat pouze početní změny jako jsou delece či duplikace, neodhalí však balancované přestavby jako jsou translokace či inverze. K nevýhodám patří i vysoká citlivost na kontaminaci.

V dnešní době je v naší laboratoři využíváno 6 reakčních MLPA kitů. Kit P250 pro detekci DiGeogeova syndromu, P245 a P297 pro mikrodeleční screening, P070 a P036 při subtelomerickém screeningu pacientů s mentální retardací a metylačně specifický kit pro rozlišení syndromů: Beckwith-Wiedemann syndrom (BWS) Russell-Silver syndrom (RSS) číslo ME030.

Technika array-CGH je primárně určená k vyhledávání delecí a duplikací v genomu pacientů. Vznikla spojením výhod klasické CGH a DNA mikročipů a dala by se charakterizovat jako CGH využívající místo metafázních chromozomů krátké fragmenty DNA uchycené na sklíčko. Může jít o oligonukleotidy, BAC, PAC nebo cDNA klony. Od velikosti a rozložení uchycených fragmentů se odvíjí rozlišení daného typu mikročipu, které může nabývat hodnot od desítek bází až po kilobáze. Celkově je však řádově vyšší než u klasické CGH, což posouvá cytogenetickou diagnostiku na molekulární úroveň.

Postup array-CGH je založen na stejném principu jako u techniky CGH. Zkoumaná a referenční DNA se izoluje z buněk pacienta resp. zdravého dárce a značí se pomocí barevně odlišných fluorochromů. Označené DNA jsou smíchány v ekvimolárním poměru a hybridizovány na oligonukleotidové fragmenty uchycené na čipu. Po hybridizaci následuje odmytí nenavázaných sond a hodnocení pomocí speciálního snímacího zařízení - scaneru. Ten nasnímá obraz čipu pomocí laseru v zelené i červené barvě.

Speciálně navržený software pak automaticky identifikuje každý spot na čipu a stanoví poměr obou fluorochromů. Jestliže je log2 normalizovaného poměru fluorochromů větší než 0, hovoříme o ziscích, v opačném případě o ztrátách genetického materiálu. V dalším kroku pak dochází k přiřazení každého spotu ke konkrétní pozici v genomu, čím se umožní zviditelnění změn na chromozomech.

Array-CGH umožňuje celogenomový skríning nebalancovaných změn s vysokou rozlišovací schopností. Její nevýhodou zůstává nemožnost odhalit balancované změny (balancované translokace či inverze).

Metoda sekvenování „nové generace“ (NGS) je primárně určena pro vyhledávání změn v sekvenci DNA v genomu pacientů.

Cílem této analýzy je detekce změn v sekvenci DNA ve vybraných oblastech (cílené NGS), v kódujících oblastech genomu (exomové NGS) nebo v rámci celého genomu (celogenomové NGS).